Возможности использования бактериологического исследования при глазных заболеваниях ограничены пределами доступности патологического очага. При расположении его в заднем отрезке глаза получить материал для исследования часто очень Трудно и возможность бактериологической диагностики в таких случаях, естественно, исключается. Основная область применения бактериологической диагностики в глазной практике — это заболевания наружного отдела глаза, а также проникающие ранения, при которых материал для исследования может быть получен во время хирургической обработки раны или при извлечении инородного тела. Вообще надо заметить, что при оперативных вмешательствах круг возможностей для получения бактериологического материала значительно расширяется.

Получение материала для исследования

Для получения материала из конъюнктивального мешка пользуются платиновой петлей (при ее отсутствии можно использовать петлю, изготовленную из нити спирали электроплитки, или другой инструмент (стеклянная палочка, шпатель и т. п.), которую предварительно стерилизуют прокаливанием в пламени спиртовой горелки. Оттянув нижнее веко, остывшей петлей захватывают комочек конъюнктивального отделяемого из глубины нижнего свода. При этом необходимо избегать прикосновения петли к коже и краям век, чтобы не занести в материал постороннюю микрофлору. Брать материал желательно до начала лечения и в утренние часы, когда отделяемое бывает более обильным. При отсутствии слизи и гноя (например, при исследовании здоровой конъюнктивы перед операциями) следует использовать слезную жидкость или слегка поскоблить поверхность соединительной оболочки (по Линднеру). Но лучше в таких случаях применить методику Элыннига: впустить в конъюнктивальный мешок из пастеровской пипетки одну каплю стерильного физиологического раствора или бульона и через несколько секунд отсосать эту каплю.

По тем же общим правилам получают материал из слезного мешка, выдавливая его содержимое, и с края века при язвенном блефарите, сняв предварительно корочку с язвы.

Большая осторожность требуется при взятии материала с роговой оболочки, особенно при наличии ползучей язвы роговицы. Петлю (или другой тупой инструмент) следует направлять косо к поверхности язвы и брать материал из прогрессирующего края ее. При этом необходима анестезия (3 капли 1% дикаина) и фиксация глазного яблока.

В качестве материала для исследования при проникающих ранениях глаза можно использовать отделяемое раны (если оно имеется), захватив его петлей или марлевым тампоном, пунктат передней камеры или извлеченное инородное тело, которое помещают в стерильную пробирку с 1-2 мл физиологического раствора. После встряхивания пробирки раствор используют для исследования.

Из передней камеры материал для исследования может быть получен с режущего инструмента во время парацентеза или посредством пункции. После анестезии роговицы (3 капли 1% раствора дикаина) и фиксации глазного яблока косо у лимба вкалывают иглу шприца, вводят ее в переднюю камеру (осторожно, не ранить радужную оболочку и капсулу хрусталика!) и отсасывают 0,3 мл содержимого передней камеры.

При эндофтальмите может возникнуть потребность в получении материала из стекловидного тела. Пункция глазного яблока проводится после анестезии (1 мл 2% раствора новокаина под конъюнктиву) острой и с достаточно широким просветом иглой, вкалываемой ближе к экватору. Отсасывается 0,3-0,5 мл внутриглазного содержимого.

Полученный материал подвергается изучению с целью выявления микроба и определения его вида (микробиологический диагноз). Материал может изучаться:

1. на предметном стекле (бактериоскопический метод);
2. в посевах (собственно бактериологический метод);
3. в эксперименте на животном (биологический метод).

Бактериоскопический метод

может быть использован в условиях любого глазного стационара при наличии несложного лабораторного оборудования и некоторых реактивов.

Для этого необходимо иметь следующее:

1. металлическую петлю;
2. чистые предметные стекла (на чистом стекле капля воды расплывается, а не принимает шаровидную форму);
3. ванночку с подставками для предметных стекол (стеклянные палочки или толстая медная проволока);
4. дистиллированную воду;
5. спирт;
6. пинцет;
7. фильтровальную бумагу;
8. раствор Люголя (йода 1 г, йодистого калия 2 г, дистиллированной воды 300 мл);
9. растворы красок (лучше в склянках, закрытых пипетками с резиновыми баллончиками).

Для очистки новые стекла кипятят в 1% растворе соды (можно использовать золу), а затем промывают водой, слабой соляной кислотой и вновь водой. Стекла, бывшие в употреблении, помещают на 1-2 часа в серную кислоту, после чего кипятят в растворе соды, промывают водой и опускают в 96° спирт. Хранят стекла либо в спирте, либо, вытерев спирт, сухими, в банках с притертой пробкой.

Наиболее употребительные краски: карболовый фуксин Циля (фуксина основного 1 г, кристаллической карболовой кислоты 5 г, спирта 96° 10 мл, глицерина — несколько капель, дистиллированной воды 100 мл). Для окраски фуксин Циля обычно разводят дистиллированной водой в 10 раз (разведенный, или водный фуксин). Метиленовая синька (метиленовой синьки 10 г, спирта 96° 100 мл). Из нее готовят щелочную синьку Леффлера (спиртового раствора синьки 30 мл, 1% калийной или натриевой щелочи 1 мл, дистиллированной воды 100 мл). Карболовый генцианвиолет (готовится так же, как карболовый фуксин Циля).

Микробов изучают либо в живом виде (способы «раздавленной» и «висячей» капли), либо убитыми (в окрашенном препарате). Исследование в живом виде в основном выявляет способность микробов к активному движению, тогда как окрашенные препараты позволяют хорошо изучить их морфологию.

Различают простые способы окраски, когда обычно употребляется одна краска, и сложные способы окраски, выявляющие некоторые особенности физико-химического строения микробной клетки и имеющие поэтому дифференциально-диагностическое значение.

Техника приготовления окрашенных препаратов сводится к следующему. Материал наносят на чистое предметное стекло и равномерно распределяют по поверхности в виде кружка или овала. Мазок должен быть достаточно тонким. При наличии густого гноя следует предварительно нанести на предметное стекло одну каплю дистиллированной воды и размешать материал в этой капле. Мазок высушивают на воздухе. Стекло с высушенным препаратом берут за края большим и указательным пальцами мазком кверху и фиксируют троекратным проведением через пламя спиртовой горелки (на границе светлой и темной его части). При достаточной фиксации ощущается легкое жжение в пальцах. Зафиксированный мазок окрашивают. Готовят несколько препаратов, по меньшей мере два, один из которых окрашивают простым способом (метиленовая синька Леффлера, разведенный фуксин Циля), другой — по способу Грама.

Окрашивание по Леффлеру:

1. на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор синьки Леффлера на 3-5 минут;
2. препарат промывают дистиллированной водой и высушивают.

Окрашивание по Граму:

1. на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на который наливают раствор генцианвиолета на 1-2 минуты;
2. сливают краску, снимают бумажку и, не промывая водой, наливают яа препарат люголевский раствор на 1 минуту; при этом мазок чернеет;
3. сливают люголевский раствор и обесцвечивают мазок спиртом (лучше путем погружения препарата в стаканчик со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек);
4. тщательно промывают водой;
5. заливают мазок разведенным фуксином на 1-2 минуты;
6. сливают краску, промывают препарат водой и высушивают.

Удобный способ Грама в модификации Синева, который предложил пользоваться заранее приготовленными кусочками фильтровальной бумаги, пропитанной раствором генцианвиолета и высушенной. На мазок предварительно наносят 2-3 капли воды и затем кладут эти кусочки бумаги. Дальше поступают, как описано выше.

Микроскопию мазков производят с иммерсионным объективом. При окраске по Леффлеру все микробы окрашиваются в синий цвет; при окраске по Граму — либо в сине-фиолетовый (грамположительные микробы), либо в красный цвет (грамотрицательные микробы).

Ограниченное число микробов, участвующих в заболеваниях наружного отдела глаза, и их характерные морфологические признаки нередко позволяют поставить правильный микробиологический диагноз уже с помощью одного только бактериоскопического исследования.

Бактериологический метод

становится необходимым в тех случаях, когда изучение в мазках оказывается недостаточным для установления вида микроба или возникает потребность в определении чувствительности выделенного возбудителя к антибактериальным препаратам.

Отсылая за подробным ознакомлением с бактериологическим методом к специальным руководствам по микробиологии, остановимся здесь лишь на принципах этого метода. Первый этап работы сводится к выделению отдельных видов микробов, т. е. к получению чистых культур. Для этого прибегают к механическому разобщению материала при посеве и к использованию сред, наиболее пригодных для развития предполагаемых возбудителей (элективные среды). Путем пересева отдельных колоний, выросших на среде, получают чистую культуру, которую исследуют под микроскопом (готовят мазки) и пересевают на дифференциально-диагностические среды для изучения биохимических свойств возбудителя.

Высокая требовательность большинства патогенных для глаза микробов в условиях культивирования обусловила преимущественное применение для их выделения элективных сред, содержащих нативный белок. Таковы, например, среда Эльшнига (одна часть лошадиной сыворотки или асцитической жидкости и две части бульона), свернутая сыворотка Леффлера (три части сыворотки и одна часть бульона с 1% пептона, 0,5% NaCl и 1% виноградного сахара), кровяной агар Левенталя (агар и 5-10% дефибринированной крови).

Что касается определения чувствительности микробов к антибиотикам, то наиболее простой способ такого определения заключается в использовании специально изготовляемых промышленностью дисков из фильтровальной бумаги, пропитанных растворами антибиотиков и высушенных в вакууме. Материал для исследования (гной, пунктат, извлеченное инородное тело) помещают в стерильную пробирку с физиологическим раствором (1,5-2 мл). После встряхивания жидкость выливают в чашки Петри, лучше в две — одну с сахарным, другую с кровяным агаром — и покачиванием равномерно распределяют по поверхности среды. Затем на поверхность агара накладывают диски с различными антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашек. Чашки ставят в термостат (37°) и на следующий день по величине зоны задержки роста вокруг дисков судят о степени чувствительности микроба к испытуемым антибиотикам. Отсутствие зоны задержки роста указывает на нечувствительность микроба к данному антибиотику.

Биологический метод

в глазной практике применяется только в тех случаях, когда при затрудненной диагностике токсигенное свойство может оказаться решающим в определении вида микроба (например, при дифференциальной диагностике дифтерийной палочки и палочки ксероза).

Лабораторная диагностика вирусных заболеваний глаза

В настоящее время специальное изучение вирусов, в том числе вируса трахомы (рис. 77), осуществляется с помощью культивирования их в культурах тканей (куриный эмбрион, асцит-карцинома мышей и др.) и электронной микроскопии.

Рис. 77. Клеточные включения при трахоме.

В клинической практике для диагностики трахомы применяется метод цитологического изучения соскоба конъюнктивы на наличие или отсутствие телец (включений) Провачека—Гальберштедтера. Для этого тупым скальпелем или краем предметного стекла соскабливают эпителиальный покров конъюнктивы (без крови), который наносят тонким слоем на предметное стекло, в течение 5 минут подсушивают на воздухе и фиксируют путем опускания на 15-20 минут в стаканчик с метиловым спиртом или смесью Никифорова (этиловый эфир и абсолютный спирт в равном количестве). Окраску производят в течение 3-4 часов свежеприготовленным раствором краски Романовского—Гимза (из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды). Затем препарат промывают текучей водой, подсушивают на воздухе и исследуют под микроскопом. При этом ядра эпителиальных клеток оказываются окрашенными в розовый цвет, протоплазма — в светло-синий, включения — в синий, сине-фиолетовый цвет (рис. 77). Последние представляются в виде кокковидных образований, расположенных среди мелкозернистой массы, и признаются носителями трахоматозного вируса. Они чаще обнаруживаются в свежих случаях нелеченой трахомы, но могут встречаться и при паратрахомных конъюнктивитах.

Исследования последних лет выявили новую форму контагиозного вирусного заболевания глаз — эпидемический кератоконъюнктивит, а цитологическое изучение конъюнктивального соскоба при этом заболевании позволило обнаружить в эпителиальных клетках своеобразные включения, совершенно отличные от телец Прсвачека (Б. Л. Поляк, Н. В. Плошинская).

Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

· морфология и тинкториальные свойства

· культуральные свойства (характер роста на питательных средах)

· биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)

· серологические свойства (антигенные)

· вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)

· патогенность для животных

· фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)

· чувствительность к антибиотикам

· другие индивидуальные свойства

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.

При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.

Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 11. Схема изучения колоний

№	Признак	Возможные характеристики колоний
1.	Форма	Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая
2.	Величина, мм	Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм)
3.	Характер поверхности	Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая
4.	Цвет	Бесцветные, окрашенные
5.	Прозрачность	Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные
6.	Характер краев	Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые
7.	Внутренняя структура	Гомогенная, зернистая, неоднородная
8.	Консистенция	Вязкая, слизистая, крошковидная
9.	Эмульгирование в капле воды	Хорошо, плохо

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.

Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°С на сутки.

Заключение

Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

II. МЕТОДЫ ОПЕРАЦИЙ И МЕТОДИКА ОБСЛЕДОВАНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ В ХИРУРГИИ КИСТИ

III. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

IV. Методические указания студентам по подготовке к занятию

ЦЕЛЬ:

1. Изучить методы выделения чистых культур бактерий

2. Овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.

1. Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы антибиотика. Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для взятки материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений.

2. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах.

3. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

Фамилия, имя, отчество, возраст пациента;

Предполагаемый диагноз заболевания;

Предшествующая антимикробная терапия;

Характер материала;

Дата и время взятия материала;

Цель исследования;

Название лечебного учреждения, номер отделения, палаты;

Подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):

1. Выделение чистой культуры возбудителя (1-2 суток);

2. Идентификация чистой культуры (1-3 суток).

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение морфологии, биохимических свойств и антигенной структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:

1. Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.

2. Правила оформления направления на бактериологическое исследование.

3. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

4. Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.

ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ:

1. Изучить таблицы «Методы выделения чистых культур бактерий» и «Выделение и идентификация чистой культуры».

2. Выделить из смеси бактерий чистую культуру и осуществить ее идентификацию – овладеть бактериологическим методом диагностики (Работа 1)

Это основной метод, используемый при лабораторной ди­агностике инфекционных заболеваний. Сущность бактериологи­ческого метода исследования – посев патологического материа­ла от больных и выделение чистой культуры возбудителя с по­следующей идентификацией его по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным приз­накам.

Метод выделения чистых культур, позволяющий изолиро­вать отдельные виды микробов из той или иной естественной среды их обитания, является важнейшим методом микробиоло­гического исследования. Первым, кто предложил метод выделения чистой культуры, был Л. Пастер.

Способ Пастера, основанный на применении жидких пита­тельных сред, обеспечивал выделение чистой культуры преиму­щественно из материала, содержащего один вид микроба (например, из крови при септицемии и др.). Он был менее эффек­тивен в тех случаях, когда необходимо было изолировать от­дельные виды микроорганизмов из их смеси. Между тем, в есте­ственных условиях материал для бактериологического исследования (мокрота, гной, почва, вода и др.) чаще всего содержит смесь разнообразных микроорганизмов.

Успешное выделение бактериальных смесей и изолирован­ное изучение отдельных видов стало возможным благодаря усо­вершенствованию метода выделения чистых культур Робертом Кохом (R. Косh), применившим для этой цели в 1881 годуплот­ные питательные среды, на которых при посеве удается распре­делить материал таким образом, что отдельные микробные клет­ки располагаются изолированно друг от друга. При соответ­ствующих условиях (питательная среда, оптимальная температу­ра) размножение изолированных клеток дает потомство одного и того же вида, т.е. чистую культуру данного вида микробов .

Через известный период (чаще всего через сутки) на тех мес­тах плотной питательной среды, на которых оказались изолиро­ванные клетки, образуются популяции размножившихся микро­бов – так называемыеколонии, видимые невооруженным гла­зом. Они не представляют собой хаотического скопления микро­бов, о чем можно судить уже по тому, что для многих видов мик­робов колонии имеют характерную структуру, в силу чего можно ориентировочно определить флору исследуемого материала и выбрать те колонии, которые подлежат дальнейшему изучению. Пересев таких колоний на соответствующую питательную среду и представляет собой выделение чистой культуры.

Выделение чистых культур с последующей их идентифика­цией имеет первостепенное значение в диагностике инфекцион­ных заболеваний, обеспечивая быстрое их распознавание, свое­временное лечение и профилактику. Оно не менее важно в определении микрофлоры при исследовании санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды (воздух, вода, почва и т.д.), а также при выполнении научных исследований.

В настоящее время имеются многочисленные методы выде­ления чистых культур. Некоторые из них используются ограни­ченно, другие находят широкое применение. Наиболее универ­сальными являются излагаемые ниже методы выделения чистых культур бактерий (метод Дригальского). В то время как другие микроорганизмы – спирохеты, простейшие – требуют применения специальных методов выделения или совсем не могут быть выделены на искусственных питательных средах (некоторые простейшие, риккетсии, вирусы).

Методы выделения чистых культур из микробных смесей принято делить на две основные группы: методы, основанные на принципе механического разобщения микробов в питательной среде, и методы, основанные на использовании биологических свойств микробов. Первая группа включает методы изолирова­ния отдельных клеток: 1) в глубине питательной среды; 2) на поверхности среды и 3) под контролем глаза. Во второй группе ис­пользуют такие свойства микробов, как их подвижность, отно­шение к температуре, кислороду и их патогенные свойства.

Техника посева и пересева

Посевом в микробиологической практике называют внесе­ние в стерильную питательную среду какого-либо исследуемого материала для обнаружения микроорганизмов.

Пересев – это перенос выращенных микроорганизмов в стерильную среду. Посевы и пересевы микробов являются одним из наиболее распространенных приемов в микробиологической практике.

Пересевы производят так, чтобы в питательную среду не попали из воздуха или с поверхности окружающих предметов посторонние микроорганизмы. Для этого необходимо строго со­блюдать следующие приемы:

1) посевы производят непосредственно около зажженной горелки, в пламени которой стерилизуют петли, пинце­ты, ватные пробки, края пробирок;

2) в левую руку берут одну пробирку с пересеваемой куль­турой, другую (со стерильной питательной средой) дер­жат в наклонном положении между большим и указа­тельным пальцами;

3) петлю держат в вертикальном положении над пламенем горелки и прокаливают ее металлическую часть докрас­на, а затем наклоняют горизонтально и стерилизуют держатель петли;

4) вынимают ватные пробки и держат их безымянным пальцем и мизинцем правой руки; класть пробки на стол или на какой-нибудь предмет не рекомендуется;

5) обжигают края обеих пробирок;

6) вносят петлю в пробирку с пересеваемой культурой осторожно, не касаясь стенок, захватывают каплю жид­кости или небольшое количество налета на твердой среде и переносят, стараясь не задеть стенок, во вторую про­бирку с обеспложенной питательной средой;

7) петлю вынимают, обжигают края пробирок и внутренние концы пробок. Если ватная пробка загорится, то ею за­крывают пробирку, а наружный конец гасят рукой или пинцетом;

8) петлю вновь обжигают в пламени, на пробирке делают соответствующую надпись: название культуры и дату по­сева.

Посев в жидкую среду можно производить пастеровской или градуированной пипеткой. При использовании пастеровской пипетки обожженным пинцетом следует надломить запаянный конец и слегка обжечь всю пипетку. Пробирку с исследуемой культурой помещают в левую руку, а пипетку – в правую между большим и средним пальцами, зажав ее верхнее отверстие указа­тельным пальцем.

Вынув ватную пробку из пробирки, обжигают края послед­ней. Осторожно опускают пипетку в пробирку и снимают указа­тельный палец. Затем закрывают указательным пальцем верхнее отверстие пипетки, вынимают ее из пробирки. Ватную пробку и края пробирки, перед тем как закрыть, обжигают. Исследуемый материал переносят в жидкую среду. После по­сева пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.

Посев на плотные среды. При посеве на косой агар наносят прямой или зигзагообразный штрих. Для этого петлю с засе­ваемым материалом вводят в пробирку до скопившейся на дне конденсационной воды и осторожно, не взрыхляя агар, наносят штрих. Сплошной посев получают при размазывании посевного материала по всей поверхности косого агара.

На плотной среде в чашке Петри посев производят следую­щим образом. Питательную среду в пробирках расплавляют на кипящей водяной бане, охлаждают до 48-50°С и разливают ров­ным слоем высотой 3-5 мм в стерильные чашки. Застывшую среду подсушивают в термостате в закрытых чашках в течение 20-30 минут. Открытые чашки кладут вверх дном на полки тер­мостата, покрытые стерильной бумагой. Рядом с чашками по­мещают крышки. При подсушивании с поверхности питательной среды и внутренней поверхности чашек испаряется конденсаци­онная вода. Посев делают петлей в виде параллельных штрихов или стеклянным шпателем.

При определении вида микроба и для выращивания ана­эробов производятпосев уколом в столбик агара или желатина. Для этого пробирку переворачивают кверху дном и длинной прямой иглой с посевным материалом прокалывают столбик среды сверху вниз до самого дна. Затем иглу осторожно вынимают и пробирку закрывают обожженной ватной пробкой. Если необходимы особые меры предосторожности против инфицирования, посевы ведут в специальном шкафу для пересева чистых культур. Засеянные пробирки и чашки Петри помещают в термостат для выращивания.

Микроорганизмы и споры, находящиеся внутри питатель­ных сред или на их поверхности, не могут передвигаться, а оста­ются в том месте, где они находились в момент застывания. Каж­дая клетка или спора начинает размножаться и через 2-3 дня образуетколонию – огромное количество клеток одного вида. Если колония образовалась из одной клетки, то это будет чистая культура того микроорганизма, из клетки которого она выросла.

Выросшие колонии просматривают сначала невооруженным глазом, а затем с помощью лупы или под микроскопом. При этом нельзя не заметить, что колонии отличаются по внеш­нему виду, окраске, строению и т.д.

4. Классификация бактерий. Принципы современной систематики и номенклатуры, основные таксономические единицы. Понятие о виде, варианте, культуре, популяции, штамме.

5. Методы микроскопии. Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний.

6. Методы окраски микробов и их отдельных структур.

7. Морфология и химический состав бактерий. Протопласты. L – формы бактерий.

8. Ультраструктура бактерий.

9. Спорообразование у бактерий. Патогенные спорообразующие микробы.

10. Капсулы у бактерий. Методы их обнаружения.

11. Жгутики и включения у бактерий. Методы их обнаружения.

14. Рост и размножение бактерий. Кинетика размножения бактериальной популяции.

15. Морфология и ультраструктура риккетсий. Морфология и ультраструктура хламидий. Патогенные виды.

16. Морфология и ультраструктура спирохет. Классификация, патогенные виды. Методы выделения.

17. Морфология и ультраструктура микоплазм. Патогенные для человека виды.

18. Систематика и номенклатура вирусов. Принципы современной классификации вирусов.

19. Эволюция и происхождение вирусов. Основные отличия вирусов от бактерий.

20. Морфология, ультраструктура и химический состав вирусов. Функции основных химических компонентов вируса.

21. Репродукция вирусов. Основные фазы репродукции вирусов. Методы индикации вирусов в исследуемом материале.

22. Вирусологический метод диагностики. Методы культивирования вирусов.

23. Культуры клеток. Классификация клеточных культур. Питательные среды для культур клеток. Методы индикации вирусов в культуре клеток.

24. Морфология, ультраструктура и химический состав фагов. Этапы репродукции фагов. Различия между вирулентными и умеренными фагами.

25. Распространение фагов в природе. Методы обнаружения и получения фагов. Практическое использование фагов.

26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

27. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам.

28. Ферменты бактерий, их классификация. Принципы конструирования питательных сред для изучения ферментов бактерий.

29. Основные принципы культивирования бактерий. Факторы, влияющие на рост и размножение бактерий. Культуральные свойства бактерий.

30. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

31. Микрофлора почвы, воды, воздуха. Патогенные виды, сохраняющиеся во внешней среде и передающиеся через почву, воду, пищевые продукты, воздух.

32. Санитарно – показательные микроорганизмы. Коли – титр, коли – индекс, методы определения.

34. Взаимоотношения между микроорганизмами в ассоциациях. Микробы – антагонисты, их использование в производстве антибиотиков и других лечебных препаратов.

35. Влияние на микробы физических, химических и биологических факторов.

36. Стерилизация и дезинфекция. Методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.

38. Формы и механизмы наследственной изменчивости микроорганизмов. Мутации, репарации, их механизмы.

43. Генетика вирусов. Внутривидовой и межвидовой обмен генетическим материалом.

44. Основные группы антимикробных химиопрепаратов, применяемых в терапии и профилактики инфекционных болезней.

45. Антибиотики. Классификация. Механизмы действия антибактериальных препаратов на микробы.

26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования

Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.

В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.

При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.

Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий - элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.

При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.

В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.

На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.

Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и проверяя одновременно ее чистоту.

Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.

Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание микроорганизмов в материале.

Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам - третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.

Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.

С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.

Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат - антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям.

Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.